Keliakia, gluteeniton dieetti ja Lgr5(+)pintatreseptorit kryptan pohjan pylväsmäisissä soluissa

ESIM:  
Veressä kiertävät hematopoieettiset kantasolut (HSC) ja oletettu suoliston kantasolu(ISC) keliakiataudissa.
https://www.researchgate.net/publication/279966821_Circulating_hematopoietic_stem_cells_and_putative_intestinal_
stem_cells_in_coeliac_disease

Abstract

The intestinal stem cells (ISC) modulation and the role of circulating hematopoietic stem cells (HSC) in coeliac disease (CD) are poorly understood.

 Our aim was to investigate the longitudinal modifications in peripheral blood HSC traffic and putative ISC density induced by gluten-free diet (GFD) in CD. 

Thirty-one CD patients and 7 controls were enrolled. Circulating CD133(+) and CD34(+) HSC were measured by flow cytometry, at enrolment and after 7 days and 1, 3, 6, 12, and 24 months of GFD. Endoscopy was performed at diagnosis and repeated at 6, 12, and 24 months following GFD. 

We used the Marsh-Oberhuber score to evaluate the histological severity of duodenal damage; immunohistochemistry was employed to measure the intraepithelial lymphoid infiltrate (IEL, CD3(+) lymphoid cells) and the putative ISC compartment (CD133(+) and Lgr5(+) epithelial cells).

 At enrolment, circulating HSCs were significantly increased in CD patients and they further augmented during the first week of GFD, but progressively decreased afterwards.

 CD patients presented with villous atrophy (VA, nukan surkastuma) ), abundant IEL and rare ISC residing at the crypt base.

Upon GFD, IEL progressively decreased, while ISC density increased, peaking at 12 months. After 24 months of GFD, all patients were asymptomatic and their duodenal mucosa was macroscopically and histologically normal.

 In active CD patients, the ISC niche  (kantasolulokero)  is depleted and there is an increased traffic of circulating HSC ( hematopoieettinen kantasolu) versus non-coeliac subjects.

 GFD induces a precocious (varhaiskypsä) mobilization of circulating HSC, which is followed by the expansion of the local ISC compartment, leading to mucosal healing and clinical remission.

• Duodecim 7/2019 julkaisee artikkelin Suoliston kantasolut

 Sen on koostaneet Simon Andersson, Kalle Luopajärvi, Nalle Pentinmikko ja Pekka Katajisto

Jo 1950- luvulla tiedettiin, että suolen mitoottiset solut sijaitsevat ainoastaan kryptassa ja että tytärsolut vaeltavat sieltä pois.

Vuonna 1974 kaikkien suolen epiteelin solutyyppien osoitettiin syntyvän kryptan pohjalla Panethin solujen välissä sijaitsevista hoikista soluista, joita kutsuttiin kryptan pohjan pylväsmäisiksi soluiksi (CBC). radioaktiivisella tymidiinillä  leimattiin  koe-eläimien  CBC solut  ja tymiidiini* rikastui kuuden tunnin jälkeen kantasoluihin. Kolme päivää myöhemmin leimattu tymidiini* nähtiin nukkalisäkkeissä kaikissa erilaistuneissa soluissa ja kahden viikon päästä myös Panethin soluissa.

SUOLEN KANTASOLUT (ISC)  sijaitsevat kryptojen pohjalla, jossa ne ovat järjestäytyneet säännöllisesti PANETHIN  solujen  väliin. (CBC =  crypt base columnar cells =   kryptan pohjan pylväsmäiset solut).

PANETHIN SOLUT   erittävät  ohutsuolen luumeniin antimikrobiaalisia yhdisteitä (lysotsyymiä ja defensiinejä m.m.), joiden ansiosta suolirauhaset ovat lähes steriilejä (normaalisti). Panethin solut ovat ainoa ohutsuolen erilaistunut solutyyppi, joka ei liiku kryptasta ylöspäin nukkalisäkkeeseen, vaan suuntaa kryptan pohjalle.

KANTASOLUT (CBC)  jakautuvat kryptan pohjalla  kerran päivässä ja tytärsoluista toinen liikkuu ylöspäin monistamisvyöhykkeeseen  (transit-amplifying zone), missä ne noin kahden päivän kuluessa jakautuvat edelleen neljästä viiteen kertaan kunnes lopulta erilaistuvat.

Muut erilaistuvat solut vaeltavat  krypta-nukkalisäkeakselia pitkin ja saavutettuaan nukkalisäkkeen pään käyvät läpi ohjelmoituneen solukuoleman ( apoptoosi) sekä karistuvat luumeniin, jossa ne sekoittuvat mikrobien ja sulamattomien ruuan osien kanssa ulosteeksi.

Lgr5 

Kantasolujen tunnistaminen helpottui vuonna 2007, kun osoitettiin, että CBC:t ilmentävät -pintareseptoria (leusiinipitoisen toiston sisältäviä G-proteiiniin kytkeytyneitä 5-reseptoreja).

(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5), Lgr5. 

Suolistosyöpätutkimuksessa tapahtuu Wnt-signalointireitin  muutoksia ja  niistä muutoksista valikoitiin 80 geenin ryhmä. Näistä geeneistä suurin osa ilmeni laajasti normaalissa suolessa, mutta pieni osa osoitti spesifistä ilmentymistä kryptan pohjalla Panethin solujen välissä (siis  CSC soluissa).

Yksi näistä oli Lgr5. Kun Lgr5 löydettiin kantasoluista , sen toimintaa ei vielä tunnettu, mutta myöhemmin havaittiin, että se on itse asiassa kantasoluille välttämätön Wnt-signaloinnin vahvistaja. Yksittäistä Lgr5(+) solua seuraamalla osoitettiin, että kaikki erilaistuneet solut nukkalisäkkeissä  (villus)  olivat lähtöisein Lgr5-positiivisista soluista ja että vielä monen kuukauden jälkeenkin  leimatut Lgr5- positiiviset solut  pysyivät kryptan pohjalla.

Lgr5 esiintyy myös monien muiden kudosten kantasoluissa, esim. mahalaukussa (ventriculus), haimassa (pancreas) , maksassa( hepar), munuaisissa ( renum) ja maitorauhasissa ( gl. mammae).

Seuraava iso edistysaskel oli Lgr5-positiivisten kantasolujen eristäminen ja viljeleminen koeputkessa (in vitro)(2009).

Organoidien, minikudosten, kasvattaminen mahdollistui:

 Organoidit kasvatetaan  tyypillisesti soluväliaineen proteiineista koostuvassa kolmiulotteisessa geelissä, jossa kantasoluista voidaan sopivien kasvutekijöiden avulla tuottaa kyseisen kudoksen solu- ja kudoshierarkiaa muistuttavia organoideja. 

Entä suolen organoidit?

Suolen organoidit muistuttavat  todellista suolta monella eri tavalla. Kantasolut sijaitsevat organoidien kryptoissa, joissa ne jakautuvat ja tuottavat epiteelin kaikkia solutyyppejä. Organoidien avulla suolen epiteelin uudistumista on voitu tutkia entistä kontrolloidummin. Ne tarjoavat erinomaisen työkalun kantasolubiologiaan, syöpätutkimukseen ja uusien lääkeaineiden seulontaan.

NICHE, kantasolulokero, kantasolujen pesä 

Yksilön kantasolut sijaitsevät näissä mikroympäristöissä, kantasolujen pesissä, kantasolulokeroissa. Suolistossa tämä lokero on kryptan pohjalla, missä Lgr5(+) kantasolut sijaitsevat.  Lokeron tehtävä on suojella kantasoluja ympräistön rasituksilta ja estää erilaistumiseen johtavien signaalireittien toimintaa. Lisäksi kantasolulokero määrittää, kuinka paljon kantasoluja on.  Liian vähäinen määrä voi johtaa kudoksen uusiutumiskyvyn heikkenemiseen, kun taas suuri kantasolumäärä lisää liikakasvun ja syövän riskiä.  

OHUTSUOLESSA kantasolut sijaitsevat erilaistuneiden Panethin solujen välissä. PANETHIN solut osallistuvat synnynnäisen immuniteetin toimintaan säätelemällä mikrobiflooran koostumusta. Vuonna 2009   havaittiin, että nämä solut myös tuottavat kantasoluille tärkeitä Wnt-, D11- ja epidermaalisia kasvutekijöitä Myöhemmin osoitettiin, että Panethin solut aistivat  yksilön ravitsemustilaa. Kun ruokaa saadaan runsaasti, Panethin solut ohjaavat  kantasoluja tuottamaan lisää ravinnon imeytymiseen tarvittavaa kudosta. Ravinnon vähetessä  panethin solut lisäävät kantasolujen määrää, jota ravinnon lisääntyessä sen imeytymineen tarvittavan kudoksen tuotaminen nopeutuu. 

PAKSUSUOLESSA kantasolujen tukitehtävää hoitavat (Panethin solujen sijaan) muut sekretorisen linjan solut . 

Tämän lisäksi suoliston kantasolulokeroon kuuluvat oleellisesti myös epiteelinalaiset strooman solut, jotka tuottavat paitsi Wnt-ligandeja ja erilaistumista estäviä luun morfogeneettisen proteiinin (BMP) estäjiä, myös Wnt-signaalia vahvistavia R-spondiineja, joiden  reseptori on Lgr5 kantasolumarkkeri.

Epiteelisolujen muovautuvuus

Tiehä jakaantumistahti altistaa kantasolut erilaisille vaurioille.  Lgr5-positiivisten kantasolujen lisäksi kryptassa on ehdotettu oelvan erillinen hitaammin jakautuva ja vaurioita paremmin kestävä kantasolupopulaatio. Osin historiallisista syistä tätä populaatiota kutsutaan usein +4-kantasoluiksi, ( reservikantasolu), mikä viittaa niiden sijaintiin kryptan pohjalta laskien, 

Hierarkia-malli: Tuon  toisen kantasolupopulaation on esitetty muodostavan hierarkian, jossa harvoin jakautuvat kantasolut tuottaisivat nopeasti jakautuvia kantasoluja ja vähentäisivät näin vaurioiden syntymistä hitaasti jakautuvissa soluissa. Hierarkkista mallia ei ole suoraan osoitettu vääräksi. 

Matemaattiset mallit suolen kantasoludynamiikasta tukevat yhden kantasolupopulaation mallia..

Puuttuu lisäksi toista kantasolua osoittavia markkereita.  

Useiden eri geenien ilmentymisen (Bmi1, Lrig1, Hopx, Tert) on ehdotettu määrittävän Lgr5-positiivisista soluista erillistä kantasolupopulaatiota, mutta  myöhemmissä tutkimuksissa on kuitenkin havaittu, että nämä geenit ilmentyvät "+4"-sijainnin lisäksi laajasti kryptan pohjalla ja myös Lgr5- positiivisissa soluissa. 

Nykykäsitys on että +4-solut ovat niin sanottuja reservikantasoluja, jotka aktivoituvat vasta Lgr5- positiivisiin kantasoluihin kohdistuvan vaurion seurauksena.  reservikantasoluina toimivien solujen olemassaoloon viittaavat esim. havainnot siitä, että Lgr5-positiivisten solujen hävittäminen ei pysäytä epiteelin uusiutumista. Lgr5-positiivisten solujen tärkeyden osoittavat kuitenkin kokeet, joissa niiden keinotekoinen poistaminen herkisti suolen säteilyn aiheuttamille vaurioille. 

Vauriotilanteita tarkemmin tutkittaessa on yllättäen havaittu, että selkeän hierarkian sijaan hyvin monenkaltaiset suolen solut pystyvät toimimaan reservikantasoluina. ESIM. ionisoivan säteilyn tai solunsalpajien seurauksena sekretorisen linjan eri soluiksi erikoistuvat solut tai jopa täysin erilaistuneet Panethin solut voivat palautua takaisin Lgr5-positiivisiksi kantasoluiksi ja palauttaa epiteelin uusiutumiskyvyn.  ( Huom. toimii kuten  Puolustusarmeija katastrofitilanteessa, sodassa).

Sittemmin on osoitettu myös enterosyyteiksi erilaistuvien solujenkin toimivan reservikantasoluina. 

KRYPTAN SOLUT ovat HÄMÄSTYTTÄVÄN MUOVAUTUMISKYKYISIÄ ja lähes mikä tahansa kryptan solu voi PALAUTUA kantasolulokerun (niche)  ansiosta kantasoluksi ja turvata näin suolen uusiutumisen. 

Mex3a-geeni

Lgr5- positiivisista soluista  on löydetty myös Mex3a- geeniä ilmentävä alajoukko, jonka solut jakautuvat muita Lgr5-positiivisia soluja harvemmin ja kestävät paremmin DNA-vaurioita.  On siis mahdollista, että raportoidut +4-kantasolujen ominaisuudet selittyvätkin osittain Lgr5-positiivisten solujen heterogeenisyydellä ja  osittain erilaistuneiden solujen plastisella muovautumisella kantasoluiksi.  

Kuinka nämä vaurioissa aktivoituvat eri mekanimsit suhtautuvat toisiinsa? Toistaiseksi on vielä epäselvää, mitkä solutyypit ja mekanismit ovat merkittävästi vastuussa regeneraatiosta fysiologisten vaurioiden yhteydessä tai vaihteleeko mekanismi  erityyppisten vaurioiden välillä.  Lisäksi muovautuvuutta on toistaiseksi tutkittu vain eläinmalleilla. 

SUOLISTOSAIRAUDET

Maailmanlaajuisesti toiseksi eniten syöpäkuolemia on mahalaukun ja suoliston syövistä. 

---2000- luvun alussakaan ei tunnettu kantasolujen osuutta suolistosyövän patologiassa. 

 Työkalut tämän selvittämiseksi paranivat Lgr5- kantasolumarkkerin löytämisen myötä (2007).

• Eläinmalli (hiiri): Suolen adenoomat syntyvät kantasolujen mutaatioiden vuoksi.
• Adenoomista löytyy normaalin kudoksen kaltainen soluhierarkia, jossa mutatoituneet Lgr5-positiiviset solut ylläpitävät kasvaimen kasvua;  ne solut poistamalla pystytään hillitsemään primaarikasvaimen kasvua. Löydösten perusteella syövän kasvua estävän hoidon tulisi kohdistua kasvaimen kantasoluihin, n.s. syöpäkantasoluihin ( cancer stem cell).  
• Kasvaimen muut solut ovat kuitenkin muovautuvia normaalin kudoksen tapaan ( siis: palautuvia ja uudelleen ohjelmoitavissa), ja syöpäkantasolujen poiston jälkeen erilaistuneemmat syöpäsolut muuntuvat Lgr5-positiivisiksi kantasoluiksi. Varsinaiset kantasolut eivät kuitenkaan ole ainoita soluja, jotka mutatoituessaan voivat synnyttää kasvaimia, vaan  tulehdustekijöiden ja erittäin rasvapitoisen ravinnon on osoitettu muuttavan suolen muita soluja kantasolujen kaltaisiksi ja lisäävän näin suoliston kasvainten määrää ainakin hiirikokeissa. (Beyaz S. et al. 2016:  High-fat diet enhances stemness and tumorigenicity of intestinal progenitors). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26935695

( Oma kommentti välillä:  On liian yksinkertainen  ja  tuloksiltaan   arvaamaton  keino kiertää gluteenin hankaluuksia lisäämällä ravinnon rasvoja ja öljyjä. Tästä voi ilmeisesti tulla   epäsuorasti haittaa  "tuntemattomalta taholta" eli  heikentyneestä suoliston pinnan  korjaantuvuudesta. Siis edelleenkin gluteenittomien  hiilihydraattipitoisten tuotteiden valmistuksella on tosi tärkeä sijansa).

Tulehdukselliset  suolistosairaudet ovat yhä suurempi ongelma erityisesti kehittyneissä maissa.  Tähän tautiperheeseen kuuluvien tautien (Crohnin tauti sekä haavainen ja välimuotoinen paksusuolitulehdus ) tarkka etiologia on vielä ( 2019) epäselvä, mutta monet ympäristötekijät vaikuttavat merkittävästi  taudin syntyyn.

Strooman immuunisolujen lisäksi kantasoluja tukevien Panethin solujen on hiirikokeissa havaittu osallistuvan tulehduksellisten suolistosairauksien muodostumiseen.
Mielenkiintoista on myös, että tulehduksellisia suolistosairuksia sairastavien epiteeli ylläpitää tautitilanteessa havaittuja geenien ilmentymisen muutoksia myös organoidiviljelmissä. On mahdollista, että ulehdukselliset suolistosairaudet vaikuttavat myös suoliston kantasoluihin ja niiden kykyyn tuottaa toimintakykyistä epiteeliä senkin jäkeen, kun muut ympäristön vaikutukset on eliminoitu.

Suolistosyöpien genettinen tausta tunnetaan verrattain hyvin. Kuitenkin suoliston syöpien laajakirjoisuutta enentää (yhdessä perinnöllisten ja ympäristötekijöiden kanssa)    lisämutaatioita kerryttävät, hallitsemattomasti jakautuvat syöpäsolut.
Suolen kudosnäytteistä (potilasbiopsia) voidaan jo perustaa organoidiviljelmä ja vertailla kunkin potilaan terveen kudoksen ja muuntuneiden solujen  vastetta saatavilla oleviin hoitomenetelmiin.(2016, 2018).
Tulehduspotilaasta eristettyjen  solujen vastetta  ympäristön ärsykkeisiin, ravintoon, mikrobiomiin ym voidaan tutkia organoideilla . Suolistosyöpien hoito voitaneen  jatkossa  toteuttaa nykyistä yksilöllisemmin.
Organoidit mahdollistavat myös perinnöllisten tautien hoidon paremman kohdentamisen ja niillä voi  ohjata yksittäisten potilaiden räätälöityjä hoitoja.
Tulevaisuudessa:  geenivirheiden korjaamista, suolen epiteelin korvaamista muokattujen organoidisiirrännäisten avulla ( Saini A. CF patients benefit from mini guts. 2016)
 Organoidit mahdollistavat kudostyyppisen kasvatuksen,  mutta  on vaativaa mallintaa niiden avulla epiteelin ja mesenkymaalisen kudoksen vuorovaikutusta tai mikrobiomin merkitystä  suolen luumenissa.   Asian korjaamiseksi kehitetään kudossiruja  "organ-on- a-chip" eli kasvatetaan keinotekoisesti luoduissa kanavissa suolen epiteeliä, jolloin mikrobit tai lääkeaineet voidaan annostella  "suolensisäisesti".

Tieto kudoskantasoluista on lisääntynyt merkittävästi  viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana.
Suolen kantasolututkimus on valaissut suolen uudistumisen dynamiikkaa, edesauttanut muiden kudosten kantasolujen tunnistamista ja niiden toiminnan ymmärtämistä. Ymmärretään  jo verrattain hyvin suoliston tasapainotilanteessa vaikuttavien signaalireittien toimintaa. Kuitenkin  kantasolujen merkitys ja muutokset useiden suolistosairauksien yhteydessä vaativat lisää tutkimusta,  uusimmat tutkimukset ovat paljastaneet jopa tuntemattomia solutyyppejä ja korjanneet  aikaisempia käsityksiä solujen luokittelusta. 
 Haber AL  et al.  A single cell survey of the small intestinal epithelium (2017)
Perinnöllisistä geenivirheistä johtuvien suolisto-ongelmien korjaaminen tarkan geenimuokkauksen avulla on jo mahdollista organoidiviljelmissä.  Muokattuja organoideja pystytään jo istuttamaan epiteeliin eläinmalleissa, mikä avaa uusia mahdollisuuksia lähitulevaisuudessa.